- استفاده از آن آسان باشد و به راحتی بتوان آن را حذف کرد.
- الگوی بیان واضح و مشخصی القاء کند.
پروموترهای مورد استفاده ترجیحا باید از موجودی که از نظر تکاملی با موجود مورد نظر ما فاصله دارد انتخاب شوند. بنابراین پروموترهایی که در گیاهان استفاده می شوند به طور عمده از موجوداتی مانند قارچ، باکتری اشریشیا کلی، درزوفیل یا سلول های پستانداران تهیه شده اند (Wang et al., 2003).
۲- ۵-۱-۳-۱ پروموترهای تنظیمی با الکل
مسیر بیوشیمیایی استفاده از اتانول در قارچ آسپرژیلوس نیدولانس[۴۱] ، یک سیستم اپران مثبت که پاسخ سلولی به اتانول و دیگر ترکیبات شیمیایی مشابه را کنترل می کند. اولین آنزیم در مسیر استفاده از اتانول، الکل دهیدروژناز یک (Adh-I) است که به وسیله ژن alcA کد می شود. AlcR پروتیین فعال کننده رونویسی، در حضور اتانول، اتیل متیل کتون یا دیگر الکل / کتون ها، به توالی هدف در پروموتر ژن alcA متصل می شود. این ترکیبات القاء کننده بیان ژن می باشند (Wang et al., 2003).
سیستم های پروموتری که در گیاهان استفاده می شوند از ژن alcR، بیان کننده پروتیین فعال کننده رونویسی (AlcR) و پروموتر alcA استفاده می کنند. ژن alcR تحت کنترل یک پروموتر قوی مانند CaMV 35S می باشد. در غیاب القاء کننده، پروتیین فعال کننده رونویسی (AlcR) نمی تواند به توالی مخصوص در پروموتر alcA که کنترل ژن مورد نظر را به عهده دارد، متصل شود. سیستم القایی با الکل در سیستم های نرعقیمی القایی، بیان القایی ژن های مقاومت و برای تولید بالای پرویتین های نوترکیب بخصوص آنهایی که با رشد و تولید زیست توده تداخل دارند، مورد استفاده قرار داد. با این حال مشکلاتی در رابطه با کاربرد این سیستم برای اهداف کشاورزی وجود دارد (Roslan et al., 2001).
۲- ۵-۱-۳-۲ پروموترهای تنظیمی با تتراسایکلین
اپرون مقاومت تتراسیکلین روی ترانسپوزن ۱۰ باکتری اشریشیاکلی قرار دارد. این اپران یک اپران تنظیم منفی است که میانکنش بین یک پروتئین ممانعت کننده(Tet repressor) و اپراتور tet (tetO)، باعث ممانعت از رونویسی ژنها می شود. تتراسیکلین به عنوان القاء کننده عمل می کند و با اتصال به پروتیین TetR از متصل شدنش به اپراتور جلوگیری می کند.
در گیاهان به دو روش این سیستم مورد استفاده قرار می گیرد:
- به عنوان یک سیستم پروموتری سرکوب گر مانند آن چه در بالا تشریح شد.
- به عنوان یک سیستم پروموتری فعال کننده که در آن TetR بهنژادی شده، به جای جلوگیری از رونویسی باعث فعال کردن رونویسی می شود که برای اولین بار در گیاه توتون مورد استفاده قرار گرفت (Gatz et al., 1991) و سپس در دیگر گیاهان نیز استفاده شد.
با توجه به مشکلات سیستم پروموتری سرکوب گر، TetR به یک فعال کننده رونویسی ژن تبدیل شد. در یک نوع از این سیستم، TetR به توالی فعال سازی اسیدی[۴۲] پروتیین VP16 ویروس هرپس سیمپلکس متصل شده و یک پروتیین فعال کننده رونویسی با تتراسایکلین[۴۳] تولید می کند. در نبود تتراسایکلین، tTA به توالی اپراتور tet که بالا دست جعبه TATA در پروموتر هدف قرار دارد، متصل شده و باعث فعال سازی رونویسی می شود. تتراسایکلین اضافه شده، با tTA کمپلکس تشکیل داده و اپراتور آزاد می شود و رونویسی از ژن متوقف می شود. برخلاف TetR که نوع وحشی می باشد، ،tTA نیاز به رقابت با عوامل نسخه برداری داخلی برای اتصال ندارد. این سیستم در آرابیدوپسیس و توتون مورد استفاده قرار گرفته است (Gossen et al., 1992)
۲- ۵-۱-۳-۳ پروموترهای تنظیمی با استرویید
گیرنده گلوکوکرتیکویید پستانداران (GR) عضوی از خانواده گیرنده های هورمون های استروییدی است و همچنین با فعال سازی رونویسی ژنهای دارای پروموتر حاوی عناصر پاسخ دهنده به گلوکوکرتیکویید[۴۴](GRE) در نقش یک عامل نسخه برداری عمل می کند (Lloyd et al., 1994).
۲- ۵-۱-۳-۴ پروموترهای تنظیمی با فلزات
متالوتیونین ها[۴۵] پروتیین هایی هستند که به فرم یونی فلزات خاصی مانند مس، روی، کادمیوم، جیوه، طلا، نقره، کبالت، نیکل و بیسموت در قارچ ها، گیاهان و جانوران متصل شده و آنها را جذب می کنند. معمولا این پروتیین ها غنی از سیستیین هستند و فاقد آمینواسیدهای آروماتیک هستند. توانایی اتصال به فلزات در این پروتیین مربوط به حضور موتیف های Cys هستند. برای مثال موتیف های Cys-Xaa-Cys در باند شدن مس دخالت دارد. محل این موتیف ها درون پروتئین در گونه های مختلف بسیار حفاظت شده است. در گیاهان، متالوتیونین در جنین زایی، ذخیره و سمیت زدایی فلزات نقش دارد. در اوایل ۱۹۹۰ سیستمی برای بیان ژن در گیاهان ابدع شد که بر اساس ژن متالوتونین قارچ و وابسته به مس بود. این سیستم [۴۶]ACE1 نامیده شد (Mett et al., 1993)
ژن های متالوتیونین از گیاهان مختلفی مانند ذرت، جو، سویا، نخود و آرابیدوپسیس و بافت های گیاهی مختلفی مانند ریشه ذرت جدا شده اند. اگرچه سیستم های پاسخ دهنده به فلزات برای تنظیم بیان ژن در بافت ها و مرحله نموی خاص مفید هستند، اما باید اثرات فلزات در دیگر بافت های موجودات تراریخت شده بررسی شود (Wang et al., 2003).
۲- ۵-۱-۳-۵ پروموترهای تنظیمی با پاتوژن ها
پروتیین های وابست
ه به پاتوژن ها گروهی هترولوگ از پروتیین ها هستند که به وسیله پاتوژن ها و مواد شیمیایی بیرونی در گیاهان تولید می شوند. پروتیین های PR مقاومت سیستمیک اکتسابی (SAR)[47] دخالت دارند که در یک گیاه مقاوم بعد از حمله پاتوژن گسترش می یابد (Odjakova and Hadjiivanova., 2001). به علت این که این پروتیین ها نه تنها به پاتوژن ها بلکه به مواد شیمیایی نیز پاسخ می دهند، توالی پروموتری این پروتیین ها برای استفاده در سیستم های القایی بیان پروتیین مورد توجه قرار گرفته اند لذا توالی پروموتری پروتیین های PR از گیاهان مختلفی مانند آرابیدوپسیس و ذرت جدا شده اند. موادی مانند سالیسیک اسید، اتیلن، تیامین، بنزول (۱،۲،۳)، تیادیازول-۷-کابوتیونیک اس متیل استر (BTS) می توانند ژن های PR را القاء کنند (Edreva., 2005). یکی از پروموترهایی که در این زمینه به خوبی مورد مطالعه قرار گرفته، پروموتر PR-1 توتون می باشد. بیان ژن بتا گلوکورونیداز(gus) هنگامی که از این پروموتر استفاده شد ۳ روز بعد از القاء با سالیسیک اسید ۵ تا ۱۰ برابر افزایش یافت و همین افزایش ۱۰ برابری در شرایط مزرعه نیز بدست آمد (Park and Kloepper., 2000).
۲- ۵-۱-۳-۶ پروموترهای القای فیزیکی
پروموترهایی که به وسیله عوامل محیطی مانند تنش آب یا شوری، دما، شرایط بی هوازی، نور و غیره تحریک می شوند، این پتانسیل را دارند که برای گسترش گیاهان مقاوم به تنش های مختلف محیطی مورد استفاده قرار گیرند.
در گیاهان پروموترهای تنظیم شونده با نور، نقشی حیاتی در تنظیم رشد و نمو از طریق تنظیم بیان ژن های پاسخ دهنده به نور دارند. عناصر پاسخ دهنده به نور از ژن هایی مانند ژن [۴۸]RbcS کد کننده زیر واحد کوچک آنزیم رابیسکو و ژن کالکون سینتاز[۴۹] به طور گسترده مورد استفاده قرار گرفته است. پروموتر ژن های Rab17 ذرت و Rd29 (Morran et al., 2011) نیز از جمله پروموترهایی هستند که پاسخ دهنده به تنش بوده و در گندم مورد استفاده قرار گرفته اند.
۲-۵-۱-۴ پروموترهای سنتزی
معمولا یک پروموتر فعال یوکاریوتی نیاز به مجموعه ای از عناصر تنظیمی دارد که در میان این ها TATA box، ناحیه شروع رونویسی یا CAP، و توالی مورد توافق CCAAT برای رونویسی دقیق مورد نیاز می باشند. از توالی این عناصر در موجودات مختلف می توان توالی مناسبی ساخت که در موجودات مختلف عملکرد مناسبی داشته باشد.
۲-۶ نشانگر های ژنتیکی
میانگین نسبتا پایین تراژنی، استفاده از سیستم های شیمیایی برای کشتن یا جلوگیری از رشد بافت های غیر تراریخت را ناگزیر ساخته است. صرف نظر از روش استفاده شده برای انتقال ژن به گندم، انتخاب نشانگرها، پروموترها و اینترون ها تاحد زیادی نتیجه نهایی را تحت تاثیر قرار خواهد داد. بعلاوه انتخاب بهتر سلول های تراژن شده با به حداقل رساندن فرار[۵۰]، شانس باززایی سلول های تراژن شده و بدست آوردن گیاهان تراریخت را افزایش می دهد.
نشانگر های مورد استفاده در مطالعات انتقال ژن به دو دسته گزارشگر و گزینشگر تقسیم بندی می شوند.
۲-۶-۱ نشانگرهای گزارشگر[۵۱]
این دسته از ژن ها محصولی را کد می کنند که فعالیت آنزیمی آن را می توان به راحتی سنجید و نه تنها بافت تراریخت را می توان تشخیص داد بلکه میزان بیان ژن خارجی در بافت های تراریخت نیز قابل اندازه گیری می باشد. شروع مطالعات انتقال ژن به گندم با انتقال ژن کلرامفنیکل استیل ترانسفراز[۵۲] (CAT) که از باکتری اشریشیاکلی بدست آمده، انجام گرفت ولی آنالیز آنزیمی مشکل این ژن و همچنین وجود بازدارنده های درون سلولی، مانع از استفاده از آن در انتقال ژن به گندم شد (Chibbar et al., 1991).
ژن uidA کد کننده آنزیم بتا گلوکورونیداز[۵۳](GUS)، هیدرولاز کننده ترکیبات گلوکورونیدی که از باکتری اشریشیاکلی بدست آمده از رایج ترین ژن های گزارشگری است که در مطالعات انتقال ژن به گندم مورد استفاده قرار گرفته است. سنجش شیمیایی آن نیاز به ۵-برومو-۴-کلرو-۳-ایندولیل بتا-دی- گلوکرونیک اسید[۵۴] دارد که تولید رنگ آبی روشن می کند (Sahrawat et al., 2003). اگرچه ژن GUS در بیشتر مطالعات انتقال ژن به گندم مورد مطالعه قرار گرفته است اما یکی از محدودیت های عمده این سیستم ماهیت مخرب سنجش آن است. بنابراین در سال های اخیر ژن های گزارشگر تولید کننده آنتوسیانین، پروتیین فلوروسنت سبز[۵۵]GFP)) و لوسیفراز (LUC) نیز در مطالعات انتقال ژن به گندم با موفقیت مورد استفاده قرار گرفته اند.
لوسیفراز از کرم شب تاب[۵۶] بدست آمده که برای تولید نور به لوسیفرین و ATP نیاز دارد (Ow et al., 1986). تجزیه لوسیفرین منجر به انتشار نور می شود که برای گیاه مضر نیست. بافت گیاهی دارای ژن لوسیفراز، رنگ سبز متمایل به زرد ساطع می کند که قسمت های تراریخت شده را مشخص می کند ( Lonsdale et al., 1998). این نشانگر نسبت به GUS از مزایای بهتری برخوردار است چرا که سنجش فعالیت لوسیفراز برای بافتها کشنده نیست، بنابراین تشخیص سری
ع سرنوشت ژن انتقال یافته در بافت های خاص امکان پذیر می گردد (Sahrawat et al., 2003).
دیگر ژن گزارشگر که در انتقال ژن به گندم مورد استفاده قرار گرفته، ژن های عامل تولید آنتوسیانین است. ژن C1 که تولید رنگیزه های آنتوسیانین در آلورون و جنین ذرت را به عهده دارد و خانواده ژنی R ذرت که مسئول ساخت رنگیزه آنتوسیانین در آلورون، بساک و کلئوپتیل هستند از جمله این ژن ها می باشد. به محض فعال سازی، این سیستم تولید رنگدانههای ارغوانی مایل به قرمز در بافت های تراریخت می کند(McCormac et al., 1998 Chawla et al., 1999 ;). پروتیین فلورسنت سبز عروس دریایی (Aequorea Victoria)، به علت اینکه بیان مناسبی داشته و سنجش آن برای بافت مخرب نیست، نسبت به سایر نشانگرهای گزارشگر محبوب تر شده است. ژن gfp کروموفوری تولید می کند که هنگام مواجه با نور فرابنفش[۵۷]، رنگ فلورسنت سبز تولید می کند (Chalfie et al., 1994). در سال های اخیر این سیستم غیر مخرب برای بهینه سازی انتقال ژن به گندم زیاد مورد استفاده قرار گرفته است (Cui et al., 2011; Zhang et al., 2011; Pang et al., 1996).
۲-۶-۲ نشانگرهای گزینشگر
در مقایسه با نشانگر های گزارشگر، این ژن ها به سلول های تراریخت شده این توانایی را می دهند که در محیط دارای عامل انتخابی، زیستی بمانند. لذا به این دلیل که تشخیص سلولهای تراریخت شده را امکان پذیر می کنند اهمیت بسیار بالایی برخوردار هستند.
۲-۶-۲-۱ ژن های مقاومت به آنتی بیوتیک
این دسته از ژنها باعث ایجاد مقاومت به آنتی بیوتیکها می شوند لذا بافت ها و سلول های دارنده آن ها را می توان روی محیط دارای آنتی بیوتیک مربوطه انتخاب کرد در حالی که سلول های غیر تراژن شده در این محیط نمی توانند زیستی بمانند. ژن های نیومایسین فسفوترانسفراز[۵۸] (nptII) و هیگرومایسین فسفوترانسفراز[۵۹] (hpt) نشانگرهای معمول استفاده شده برای گندم می باشند. انتخاب عامل گزینشگر امری حیاتی و مبتنی بر گونه گیاهی است که تراژن خواهد شد (Razzaq et al., 2010). کانامایسین بازدارنده رشد بسیار موثر سلول های غیره تراژن است ولی برای لگوم ها و گرامینهها عاملی غیر موثر می باشد. این عامل انتخابی با باززایی سلول های تراریخت شده تداخل دارد و همچنین گیاه گندم مقاومت درونی بالایی به این آنتی بیوتیک دارد. جنتیسین (G418)، دیگر عضو خانواده آمینوگلیکوزیدها را میتوان به جایگزینی موثر برای انتخاب سلولهای تراریخت شده با nptII استفاده کرد (Cui et al., 2011).
ژن هایگرومایسین فسفوترانسفراز که از باکتری اشریشیاکلی بدست آمده از جمله ژنهای گزینشگری است که با بهره گرفتن از آن و آنتی بیوتیک هایگرومایسین گیاهان زیادی از جمله تک لپه ای ها تراریخت شده اند. اکثر گیاهان، مخصوصا غلات، حساسیت بیشتری به هایگرومایسین در مقایسه با کانامایسین دارند. بنابراین این سیستم انتخابی برای انتقال ژن به گندم نسبتا کاراتر و موثرتر است و گزارش شده که نسبت به ژن bar کارایی بالاتری در گندم دارد (Ortiz et al., 1996).
۲-۶-۲-۲ ژن های مقاومت به علف کش
ژن های ایجاد کننده مقاومت به علف کش ها، نشانگرهای گزینشگر هستند که به عنوان جایگزین ژن های مقاومت به آنتی بیوتیک ها در انتقال ژن به گندم مورد استفاده قرار گرفته اند. این سیستم معمولا در انتقال ژن به گیاهان کاراتر بوده چرا که مرگ سلولی در حضور علف کش سریعتر و کامل تر اتفاق می افتد لذا انتخاب موثرتری انجام می شود. ژن های ایجاد کننده مقاومت به علف کشهایی مانند بستا، بیالوفاز، تریازینس، سولفونیل اوره، بروموکسینیل، گلیفوزات و فسفینوتریسین به راحتی در دسترس هستند (Razzaq et al., 2010). سه ژن مقاومت به علف کش در انتقال ژن به گیاهان مورد استفاده قرار گرفته است. اولین آنها ژن کد کننده فسفینوتریسین استیل ترانسفراز[۶۰] (pat/bar) است که از باکتری استرپتومایسز[۶۱] جدا شده به طور گسترده به عنوان نشانگر گزینشگر در حضور عامل انتخابی فسفینوتریسین که گلوتامین سینتاز را سرکوب می کند، مورد استفاده قرار گرفته است. انتخاب بر پایه فسفینوتریسین از رایج ترین سیستم های مورد استفاده در غلات می باشد. فسفینوتریسین آنالوگ گلوتامات بوده عامل فعال علف کشهای بیالوفاز و بستا می باشد. عمدهترین مشکل این سیستم، باززایی تعداد زیادی گیاه غیر تراژن می باشد (Sahrawat et al., 2003). ژن های cp4 و [۶۲]gox دیگر ژن های مقاومت به علف کش بوده که به عنوان نشانگرهای گزینشگر در انتقال ژن به گندم مورد استفاده قرار گرفته اند (Zhou et al,. 1995; Hu et al., 2003). ژن CP4 از سویه CP4 مقاوم به گلی فوزات باکتری آگروباکتریوم بدست آمده است و آنزیم انول پیروویل شیکیمات-۵-فسفات سینتاز[۶۳]( (EPSPS) را کد می کند (Kishore et al., 1992). ژن GOX آنزیم گلی فوزات اکسیدورداکتاز را کد می کند که از اکرموباکترها بدست آمده است (Barry et al., 1992). هر دو ژن مذکور باعث ایجاد مقاومت به گلی فوزات، عامل فعال علف کش رانداپ می شوند.
۲-۶-۲-۳ ژن های نشانگر متابولیکی
این سیستم، یک سیستم انتخابی مثبت است که توانایی های متابولیکی به
سلول های تراریخت شده می دهد و از نظر محیطی سیستمی ایمن می باشد. سلول های حاوی این ژن های گزینشگر این توانایی را دارند که ترکیباتی ضروری رشد خود را بسازند در حالی که سلول های دیگر این توانایی را ندارند. معمولا محیط کشت مورد استفاده فاقد ترکیب مورد نظر می باشد. بنابراین فقط سلول هایی که تراریخت شده اند می توانند ترکیب مورد نظر را بسازند و رشد کنند. ژن manA[64] یا pmi پیشرفته ترین سیستم انتخاب مثبتی است که تا به امروز در گندم مورد استفاده قرار گرفته است (Negrotto et al., 2000). در این سیستم مانوز منبع کربن بوده و محیط فاقد سوکروز است. سلول های تراریخت دارای فسفومانوز ایزومراز (PMI) می توانند مانوز-۶-فسفات با تبدیل به فروکتوز-۶-فسفات، به عنوان منبع کربن مورد استفاده قرار دهند و زیستی بمانند. راندمان بالای انتقال ژن به و عدم تولید گیاهان غیر تراریخت با بهره گرفتن از این سیستم در گندم بدست آمده است. (Wright et al., 2001).
ژن cah کد کننده آنزیم سیانامید هیدراتاز[۶۵] که از قارچی خاکزی[۶۶] بدست آمده نیز در انتقال ژن به گندم مورد استفاده قرار گرفته است (Weeks et al., 2000) که سلول های حاوی آن می توانند در محیط دارای سیانامید رشد کنند. سیانامید ماده شیمیایی است که در تولید پلاستیک کاربرد دارد که می تواند در این سیستم به عنوان منبع نیتروزن مورد استفاده قرار گیرد. ژن [۶۷]gst27 ذرت نیز در انتقال ژن به گندم مورد استفاده قرار گرفت که گیاهان تراریخت بدست آمده دارای مقاومت به علف کش آلاکلر[۶۸] بودند. در حال حاضر فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز این ژن تایید شده است بنابراین امکان استفاده از این ژن در تولید گیاهان تراریخت مقاوم به استرس های محیطی و پاتوژن ها وجود دارد ( Sahrawat et al., 2003).
۲-۷ خاموشی تراژن در گندم
موفقیت در بهبود خصوصیات گندم با بهره گرفتن از مهندسی ژنتیک وابسته به بیان پایدار ژن انتقال یافته می باشد. خاموشی ژن پدیده ای عمومی در گیاهان تراریخت است که کنترل آن امری ضروری می باشد. خاموشی ژن هم در هنگام رونویسی و هم بعد از رونویسی اتفاق می افتد. ژنوم بزرگ و پیچیده گندم مستعد ایجاد خاموشی تراژن می باشد (Patnaik and Khurana., 2001). متیلاسیون DNA نقش بزرگی در ناپایداری و ایجاد حالت غیرفعال ژن، با تغییر ساختار کروماتین و عدم دسترسی برای رونویسی دارد (Razin., 1988). مشکل خاموشی ژن در گندم را می توان با بهینه سازی روشی برای الگوی ساده ورود ژن به ژنوم، استفاده از پروموترها و توالی های جدا شده از غلات به حداقل رساند (Meyer., 1995).
۲-۸ انتقال صفات با ارزش به گندم
موضوعات: بدون موضوع
لینک ثابت