Quality control:
Gene name:C ext
Clone ID#:D5305-4
RES: HindIII
شکل ۴-۶. تائید اندازه ژن سنتز شده به کمک هضم آنزیمی
- تائید صحت قابلیت تکثیر ژن به کمک تکنیک PCR و عدم وجود هرگونه آلودگی در آن
- کیفیت مناسب DNA سنتز شده به کمک تکنیک اسپکتروسکوپی^[۵۸] و عدم وجود هرگونه آلودگی در آن
- شکل ظاهری شفاف و عدم وجود هرگونه ذره ی خارجی در آن
سفارش مذکور به شکل پودر لیوفیلیزه و در حجم ۱۰ میکروگرم دریافت شد و سپس با توجه به دستور العمل شرکت سازنده بصورت استوک قابل استفاده درآمد. نقشه ی ژنی پلاسمید حاوی DNA ناحیه C2در شکل ۴-۷ نمایش داده شده است. در این شکل جایگاه ژن مورد نظر، نحوه قرار گیری آن در
پلاسمید حامل، جایگاه های آنزیم های محدود کننده و همچنین جایگاه ژن مقاومت به آنتی بیوتیک آمپی سیلین نشان داده شده است.

شکل ۴-۷. نقشه ی ژنی پلاسمید حاوی DNA ناحیه C2 پروتئین ALCAM
۴-۳ کلونینگ پلاسمید- AMP⁺ pBSK حاوی DNA ناحیه C2
برای تکثیر پلاسمید حاوی ژن سنتز شده، ارسال شده توسط شرکت تولیدی، فرایند ترانسفورمیشن بر روی باکتری های کامپتنت E.coli سویه Top 10 انجام شد و از کلونی های رشد کرده در محیط حاوی آنتی بیوتیک آمپی سیلین، تک کلونی انتخاب شد و در محیط LB مایع کشت داده شد و سپس از تک کلونی کشت داده شده به روش لیز قلیایی استخراج پلاسمید صورت گرفت. و برای تائید حضور پلاسمید در محلول بدست آمده، الکتروفورز انجام شد. با مشاهده نمودن باند bp 3725 در ژل، حضور پلاسمید حاوی ژن ناحیه C2 به اثبات رسید. در شکل ۴-۸ نتیجه حاصل از الکتروفورز محصول استخراج پلاسمید نشان داده شده است.

شکل ۴-۸. تائید حضور پلاسمید حاوی ژن ناحیه C2 در محصول استخراج پلاسمید. از سمت راست چاهک اول نمونه پلاسمید حاوی ناحیه مورد نظر و چاهک اول از سمت چپ لدر DNA1kb- باندbp3725 مربوط به پلاسمید حاوی ناحیه C2 و محل باند ۳۰۰۰bp لدر .
پس از این که وجود پلاسمید در محصول حاصل از استخراج پلاسمید کلونی های ترانسفورم شده با پلاسمید حاوی ژن ناحیه C2 تائیید شد، به کمک تکنیک هضم دوگانه آنزیمی(double digestion)، وجود ژن ناحیه C2 در پلاسمید، با توجه به جایگاه های آنزیمی NcoI و XhoI قرار داده شده در دو سر ژن سنتز شده مورد بررسی قرار گرفت. که دو باند بر روی ژل مشخص شد،یک باند bp 818 )ناحیه (C2 و یک باند bp 2907 ( پلاسمید pBSK ) که تائیدی بر وجود ژن ناحیه مورد نظر در پلاسمید تکثیر شده دارد. شکل ۴-۹ نتیجه حاصل از هضم آنزیمی دو گانه پلاسمید تکثیر یافته pBSK را نشان می دهد.
شکل ۴-۹. هضم دوگانه آنزیمی پلاسمید تکثیر یافته pBSK- از سمت راست چاهک اول لدر DNA1kb و چاهک های دوم سوم و چهارم نمونه هضم انزیمی پلاسمید حاوی ناحیه C2–پیکان های بالا پلاسمید (bp 2907) و ناحیه C2 (bp818) –از بالا سمت چپ محل قرار گیری باند bp 3000 و ۷۵۰bp لدر.
۴-۴ ساب کلونینگ ژن ناحیه C2
جهت بیان ژن ناحیه C2 از باکتری E.coli BL21(DE3) استفاده شد . ابتدا ژن مورد نظر از روی ژل آگارز مرحله الکتروفورز خالص سازی شد و سپس به کمک تکنیک Ligation با پلاسمید pet-28a ترکیب شد. سپس این ترکیب به سلول های شایسته ی E.Coli BL21 ترانسفورم شد. در شکل ۴-۱۰، نقشه ژنی پلاسمید pet-28a نشان داده شده است.
شکل ۴-۱۰. نقشه ژنی پلاسمید pet-28a
باکتری BL21به تنهایی حساس به کانامایسین است ولی وقتی وکتور pet-28a را جذب کند نسبت به آنتی بیوتیک کانامایسین مقاوم شده و بر روی محیط کشت حاوی کانامایسین تشکیل کلونی می دهد. در شکل ۴-۱۱ کلونی های رشد کرده بر روی محیط کشت حاوی آنتی بیوتیک کانامایسین بعد از ترانسفورماسیون باکتری BL21(DE3) با پلاسمید pet-28a حاوی ناحیه C2 را نشان می دهد.
شکل ۴-۱۱ باکتری های BL21(DE3) ترانسفورم شده با pet-28a حاوی ژن ناحیه C2
سپس یکی از این تک کلونی های رشد کرده به محیط LB مایع منتقل شده و سپس از آن استخراج پلاسمید به روش لیز قلیایی صورت گرفت تا وجود پلاسمید حاوی ژن مورد نظر تائید شده و از طرفی وجود هرگونه آلودگی را از بین ببرد. برای تائید وجود پلاسمید pet-28a در محصول استخراج پلاسمید، الکتروفورز صورت گرفت و با تشکیل باند در bp 6187 ، این ادعا ثابت شد. در شکل ۴-۱۲ ، نتیجه
الکتروفورز محصول استخراج پلاسمید pet-28a از سلول های ترانسفورم شده BL21(DE3) ، نشان داده شده است.
شکل ۴-۱۲. تائید حضور پلاسمید pet-28a حاوی ژن ناحیه C2 در باکتری ترانسفورم شده BL21(DE3)- چاهک اول از سمت چپ لدر DNA1kb و چاهک های دوم سوم و نمونه هضم انزیمی pet حاوی ناحیه C2
پس از این که وجود پلاسمید pet-28a در محصول حاصل از استخراج پلاسمید کلونی های ترانسفورم شده با پلاسمید حاوی ژن سنتز شده تائید شد، به کمک تکنیک هضم دوگانه آنزیمی، وجود ژن ناحیه مورد نظردر پلاسمید، با توجه به جایگاه های آنزیمی NcoI و XhoI قرار داده شده در دو سر ژن سنتز شده مورد بررسی قرار گرفت. دو باند مورد نظر bp 818 ( ناحیه C2) و bp 5369 ( پلاسمید pet-28a ) نمایان گشت که تائیدی بر وجود ژن مولتی توپ مورد نظر در باکتری ترانسفورم شده است. شکل ۴-۱۳ نتیجه حاصل از هضم آنزیمی دو گانه پلاسمید pet-28a حاوی ژن ناحیهC2 پروتئین ALCAM را نشان می دهد.
شکل ۴-۱۳ نتیجه حاصل از هضم انزیمی دو گانه پلاسمید pet-28a حاوی ژن ناحیه C2 در باکتری ترانسفورم شده BL21(DE3)- از سمت راست چاهک اول لدر DNA1KB چاهک اول و سوم از سمت چپ پلاسمد Pet-28a حاوی ناحیه C2 و چاهک اول از سمت چپ .
۴-۵ بیان پروتئین ناحیه C2و تائید آن به کمک تکنیک SDS-page
پس از تائید ترانسفورماسیون و وجود پلاسمید حاوی ژن ناحیه C2در باکتری میزبان، با توجه به پروموتر lac در پلاسمید pet-28a (که یک پروموتور القایی می باشد)، جهت القاء بیان پروتئین در باکتری از القاگر IPTG در رقت مناسب استفاده شد. به منظور جداسازی باند های پروتئینی سلولی و ردگیری پروتئین نوترکیب در سلول های ترانسفورم شده و نیز میزان بیان پروتئین مورد نظر از الکتروفورز بر روی ژل پلی آکریل­آمید استفاده شد و عصاره های سلولی تهیه شده بر روی SDS-page الکتروفورز شدند.پس از رنگ آمیزی با کوماسی G-250 کلوئیدی، باند ۱۵ کیلو دالتون مربوط به پروتئین ناحیه C2 پروتئین ALCAM در نمونه های ۱ و ۲ ظاهر شد و علاوه بر این در نمونه های کنترل منفی باندی در این ناحیه
مشاهده نشد. در شکل ۴-۱۴، الکتروفورز پروتئین ناحیهC2 پروتئین ALCAM بر روی SDS-page 15 درصد با رنگ آمیزی کوماسی بلو نشان داده شده است.
شکل ۴-۱۴. بررسی بیان پروتئین ناحیه C2به کمک تکنیک SDS-page- از سمت چپ چاهک اول نمونه کنترل مثبت حاوی پروتئین بیان شده ناحیه C2–چاهک سوم لدر پروتئینی و چاهک دوم نمونه کنترل منفی
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری
بحث:
بیوانفورماتیک دانش استفاده از علوم کامپیوتر و آمار و احتمالات در شاخه زیست شناسی مولکولی است. گسترش روز افزون حجم عظیم داده‌های ژنومی و نیاز به ذخیره، بازیابی و تحلیل مناسب این داده‌ها، موجب پیدایش علم بیوانفورماتیک گردید. این دانش نوظهور، به عنوان یک دانش بین رشته‌ای، تلاش می‌کند تا با بهره گرفتن از تکنیک‌های موجود در علوم کامپیوتر، ریاضیات، شیمی، فیزیک و علوم مرتبط دیگر، مسایل مختلف زیست‌شناختی را که معمولاً در سطح مولکولی هستند حل کند.تلاش‌های پژوهشی اصلی در این رشته عبارتند از: تطابق توالی، کشف ژن، گردآوری ژنوم، تنظیم ساختار پروتئینی، پیش بینی ساختارهای دوم و سوم پروتئین، پیش‌بینی بیان ژن و تعاملات پروتئین- پروتئین و مدلسازی تکامل.
بیوانفورماتیک یک تخصص میان رشته‌ای است که با ادغام زیست شناسی، ریاضیات به ویژه آمار، علوم کامپیوتر و فناوری اطلاعات به وجود آمده ‌است. از مهمترین کارها در بیوانفورماتیک تجزیه و تحلیل اطلاعات توالی است. زیست‌شناسی محاسباتی نامی است که به این فرایند داده شده ‌است و شامل موارد زیر است:
پیدا کردن ژن ها در توالی های DNA
توسعه روش های پیش بینی ساختار و عملکرد پروتئین های تازه کشف شده یا نوترکیب و یا توالی RNA آن ها
طبقه بندی پروتئین های مشابه و ایجاد درخت های فیلوژنی برای بررسی روند تکاملی آن ها
مشهورترین کاربرد بیوانفورماتیک در تحلیل توالی هاست توالی های DNA مربوط به ارگانیزم های مختلف جهت دستیابی سریع و مقایسه آنها با یکدیگر ، در پایگاه های داده ذخیره میشوند.
در این مطالعه از علم بیوانفورماتیک جهت پیش بینی و بالا بردن دقت در طراحی ژن نوترکیب استفاده شد. یکی از کاربرد های بیوانفورماتیک بهینه سازی ژن نوترکیب با توجه به میزبان می باشد که در آن رایانه با بهره گرفتن از داده های پیش فرض و پارامتر های دخیل در سیستم رونویسی مثل کدون های بهینه، درصد اسید آمینه های گوانین و سیتوزین توالی و …، بهترین توالی ممکن برای ژن نوترکیب جهت بیان در میزبانی مشخص را پیشنهاد می دهد. این عمل موجب آن می شود که میزان و دقت بیان ژن طراحی شده در میزبان انتخابی بالا رود.
پروتئین ها عهده دار رفتار سلولی و تمام فعالیت هایی هستند که در سلول انجام می شود. و برای پی بردن به ارتباط ژنوم با رفتار سلول ها باید پروتئین های سلولی را شناخت. برای شناسایی مکانیسم های مولکولی
رفتار سلولی و واکنش های زیستی، لازم است پروتئین هایی که در یک سلول بیان می شود، تغییرات آن ها در شرایط مختلف، عملکرد آن ها و همچنین برهمکنش های بین پروتئین های مختلف در یک سلول، بررسی شود. مطالعه پروتئین ها به مراتب مشکل تر از مطالعه ژنوم است. زیرا پروتئین ها را نمی توان همانند DNA به روشی مشابه PCR، تکثیر کرد. همچنین توالی های پلی پپتیدی نمی توانند به توالی های اسید آمینه ای مکمل خود متصل شوند. بنابراین برای مطالعه پروتئوم باید از ابزار و روش های ویژه ای استفاده کرد. از جمله شاخص های مهم برای آنالیز بیوانفورماتیک پروتئین ها عبارتند از عملکرد و رفتار پروتئین ها، برهمکنش های بین پروتئین های مختلف، آرایش هایی که پس از ترجمه بر روی پروتئین ها ایجاد می شود و نیمه عمر آنها در سلول.
بنابراین پروتئینی نوترکیب حاصل از ژن طراحی شده باید دارای شاخص های مهمی مثل پایداری و سطح انرژی مناسب باشد که به کمک نرم افزار های بیوانفورماتیکی این شاخص ها قابل اندازه گیری می باشد.
شکل سه بعدی یا فضایی پروتئین تعیین کننده عملکرد پروتئین در سلول می باشد به همین دلیل شکل فضای پروتئین نوترکیب از اهمیت ویژه ای برخوردار است. بنابراین، از لحاظ شکل فضایی باید کمترین تفاوت را با پروتئین اصلی دارا باشند.
دو اصل مهم برای تعیین ساختار سه بعدی پروتئین از روی توالی آن وجود دارد :
الف) پروتئین ها با توالی تقریبا مشابه، شکل فضایی شبیه به هم پیدا می کنند ( جستجو برای یافتن توالی های مشابه)
ب) شکل فضایی مولکول به گونه ای است که به حداقل سطح انرژی برسد ( استفاده از قوانین شیمی، فیزیک و ترمودینامیک )
علم بیوانفورماتیک با اندازه گیری پارامترهای ساختاری پروتئین نوترکیب، قادر است میزان تفاوت آن را با پروتئین اصلی مشخص کرده و همچنین دیگر قابلیت های پروتئین نوترکیب را از لحاظ قدرت ایمنی زایی، میزان حلالیت و در دسترس بودن ناحیه C2برای آنتی بادی ها را پیش بینی کند. با رسم نمودار راماچاندران می توانیم پایداری پروتئین را بعد از ترجمه نشان دهیم بدین صورت که هر اسید آمینه ای قادر است فقط در زوایای خاصی از فضا با توجه به اسید آمینه های مجاور قرار گیرد. برای رسم این نمودار رایانه با بهره گرفتن از داده های پیش فرض زوایا برای هر اسید آمینه، مکان قرار گیری آن را در یک توالی پلی پپتیدی نشان می دهد. در صورتی که اکثر اسید آمینه ها بهترین زاویه را نسبت به هم داشته باشند ، پروتئین مورد نظر می تواند از پایداری بالایی برخوردار باشد.
برای اینکه قادر باشیم یک ژن نوترکیب را بیان کنیم لازم است که این ژن را درون یک میزبان مناسب کلون کنیم. کلون سازی ژن می تواند یک نمونه خالص از یک ژن منفرد را ایجاد کند. ( براون، ۱۹۹۵)