محلولC : ml۵٠ از محلول A با ml ١ از محلول B مخلوط شد. توجه داشته باشید که محلول C باید به صورت تازه تهیه شود و مدت زمان نگهداری آن تا حداکثر ۴٠ ساعت برای مصرف می باشد.

محلول D: محلول فولین به نسبت مساوی با آب مقطر رقیق کرده، و باید در ظروف تیره رنگ و در یخچال نگهداری کرد.

نمودار ۳-۱- نمودار استاندارد لوری
۳-۴-۱- آزمون ایمونو ژل دیفیوژن
این آزمون، صحت استخراج PRP را نشان می دهد. برای انجام این آزمون، ۸/۰ گرم آگار درcc ١٠٠ بافر باربیتول با ٢/٧pH= جوشانده تا رنگ آن شفاف گردد. مقدار جزئی سدیم آزاید برای جلوگیری از رشد میکروارگانیسم های دیگر، به محلول اضافه شدسپس آنرا در پلیت های شیشه ای تقسیم کرده تا جایی که سطح زیرین پلیت را پوشاند در حرارت اتاق رها شد تا ژل ببندد. با بهره گرفتن از انتهای پیپت پاستور، چاهک هایی بر روی هر ژل با فاصله ۵/١ سانتیمتری از هم دیگر، بر روی ژل ایجاد شدند. آنتی ژن ها ، آنتی سرم ها در جایگاه های مخصوص درون چاهک ها ریخته و پلیت ها را برای ۲۴-۷۲ ساعت در اتاقک مرطوب در دمی ۳۷ درجه سانتی گراد قرار داده تا تشکیل خطوط رسوبی مشاهده گردد.
۳-۵- سنجش نوکلئیک اسید
میزان اسید نوکلئیک موجود در پلی ساکارید به روش اسپکتروفوتومتری uv اندازه گیری گردید که در میزان اسید هسته ای کمتر از ۲۰ میکروگرم در هر گرم پلی ساکارید محاسبه شد که این مقدار قابل قبول می باشد.
۳-۶-تخلیص اگزوتوسین A سودوموناس آئروژینوزا PA103
در این پروژه از گونه استانداردسویه PA103 Liu سودوموناس آئروژینوزا جهت تهیه اگزوتوکسین A استفاده شد. این باکتری‏‏ از مرکز کلکسیون باکتری‏های استاندارد بخش واکسن‏های باکتریایی انستیتو پاستور ایران تهیه گردید.
۳-۶-۱- طرز باز کردن سوش لیوفیلیزه جدید
برای بازکردن هر سوش لیوفیلیزه دستور خاصی وجود دارد، مثلا، ممکن است گفته شود ابتدا ٣-۵ سی سی سرم فیزیولوژی یا آب مقطر داخل ویال تزریق شود. در مورد سوش PA103 ابتدا ۵ سی سی سرم فیزیولوژی تزریق شد. سپس، در ٣ مرحله در محیط کشت بروسلا براث کشت داده شد. این کشت ها در زمان های متفاوتی انجام شدند. در مرحله اول ١ ساعت، مرحله دوم ٢ ساعت و در مرحله سوم محیط کشت بروسلا آگار ٣ ساعت در درون انکوباتور در دمای ٣٧ درجه سانتیگراد، به مدت ۲۴ ساعت درون انکوباتور قرار داده شد.
۳-۶-۲-تهیه لوله بذر
یک لوله از کشت ۲۴ ساعته سویه PA103 سودوموناس آئروژینوزا به وسیله سرم فیزیولوژی شستشو داده و در ۲ لوله محیط کشت تریپتیکاز سوی براث تلقیح گردید تا از عدم آلودگی ان اطمینان حاصل گردد و به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی‏گراد انکوبه نمودیم تا سویه مورد نظررشد کند.
۳-۶-۳- اطمینان از خالص بودن سوش
قبل از تلقیح سوش به محیطها و بررسی اثر تولید اگزوتوکسین A ،برای اینکه اطمینان کامل از خالص بودن سوش و عدم حضور گونه­ های دیگر باکتریایی حاصل شود ،یک اسمیر از کشت را تهیه کردیم و به روش رنگ آمیز ی گرم رنگ شد ،سپس توسط میکروسکوپ نوری لام بررسی شد.
۳-۶-۴- تست سوش برای تولید اگزوتوکسین A
بعد از اینکه سوش خالص PA103 سودوموناس آئروژینوزا بدست آمد و از عدم الودگی آن اطمینان حاصل کردیم، آن را د ر محیط TSB به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد کشت دادیم ،سپس محتویات محیط کشت توسط سانتریفیوژ به مدت نیم ساعت با دور rpm 2000 سانتریفیوژ شدو توده سلولی را جدا کرده و مایع رویی جمع آوری شد.مایع رویی را جهت استریل کردن از فیلتر سرنگی ۴۵/۰ عبور دادیم و سپس این مایع به صورت درون صفاقی به موش تزریق شد.موشها بعد از ۲۴ ساعت کشته شدند.مرگ موشها نشان دهنده بود که اگزوتوکسین A توسط سوش مذکور تولید شده بود.
۳-۶-۵-تهیه محیط کشت
ترکیب محیط کشت تریپتیکاز سوی براث:
۱۷ گرم آنزیم هضم کننده کازئین
۳ گرم آنزیم هضم کننده سویا
۵ گرم سدیم کلراید
۵/۲ گرم دی پتاسیم فسفات
۵/۲ گرم دکستروز
-۲۰ سی سی گلیسرول
۱۰۰ سی سی گلوتامات سدیم ۱ مولار
۶۰ گرم TSB را در ml100 آب مقطر حل کرده و بر علیه سه تعویض۱ لیتری آب مقطر در دمای ۴ درجه سانتیگراد به مدت زمان ۲۴ ساعت دیالیزنمودیم . محیط دیالیزشده TSB به همراه cc 20 گلیسرول و cc 100 گلوتامات سدیم به داخل یک ظرف ریخته و با اضافه کردن آب مقطر حجم محیط را به ۲ لیتر می رسانیم و در دمای ۱۲۱ درجه سانتیگراد در فشار ۱ اتمسفر به مدت ۱۵ دقیقه اتوکلاو می کنیم. محیط کشت تریپتیکاز سوی براث تهیه شده را در درون کیسه دیالیز ریخته و به مدت یک شب در ۴ درجه سانتی گراد بر علیه سه تعویض آب مقطر دیالیز کردیم.
سویه PA103 سودوموناس آئروژینوزارا روی محیط بروسلا آگارکشت داده و داخل انکوباتور در دمای ۳۷ درجه به مدت ۱۸ ساعت قرار می دهیم. برای تهیه محیط کشت اصلی از کشت ۱۸ ساعته بروسلا آگار یک لوله را با تامپون شستشو داده و به داخل ۲ لیتر محیط TSB از قبل تهیه شده تلقیح می کنیم و به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه و با دور ۸۰ داخل انکوباتور شیکر دار قرار می دهیم. سپس در دور g3800 به مدت زمان۵۰ دقیقه سانتریفوژ می کنیم.مایع رویی حاصل از هر کرام از محیط ها جمع آوری شد.
۳-۶-۷- رسوب با استات روی ۱ مولار
بعد از سانتریفوژ بلا فاصله سوپرناتانت را به داخل یخچال ۴ درجه سانتیگراد انتقال میدهیم و۱۰۰ سی سی استات روی ۱ مولار به روی مایع بدست آمده از محیط کشت تریپتیکاز سوی براث به آرامی ( قطره قطره) اضافه کردیم. این مایه رویی به مدت چند ساعت در دمای ۴ درجه سانتی گراد نگهداری شد.سپس مایه رویی مذکور را سانتریفیوژکرده (۳۸۰۰ دور به مدت ۶۰ دقیقه در ۴ درجه سانتی گراد) و به رسوب حاصله مقداری سیترات سدیم ۰٫۳ نرمال اضافه میکنیم تا رسوب حاصله حل گردد. سه مرتبه بر علیه ۰۱/۰ مولار تریس بافر با ۸ PH= به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۴ درجه سانتی گراد دیالیز نمودیم..بعد از ۲۴ ساعت دیالیز محتوای کیسه ها سانتریفیوژ(۳۵۰۰ دور به مدت ۳۰ دقیقه در ۴ درجه سانتی گراد)شد.
۳-۶-۸- رسوب با سولفات آمونیوم:
قبل از اضافه کردن سولفات آمونیوم با اضافه کردن NAOH ، PH محلول را به ۸ رسانده ، سپس به آرامی سولفات آمونیوم خشک۶۰% اشباع که از طریق نرم افزار Amunium sulfat calculator محاسبه شده بود و بر روی مایع حاصل از محیط تریپتیکاز سوی براث معادل ۱۵۶ میلی لیتر بود اضافه شد. بعد از ایجاد رسوب با سولفات آمونیوم، سوسپانسیون با دور۳۷۰۰rpm به مدت۳۰ دقیقه سانتریفیوژ شد .مایع رویی دور ریخته و سپس رسوب را جمع آوری کردیم.
شکل ۳-۷- رسوب با سولفات آمونیوم
۳-۶-۹- دیالیز اگزوتوکسین A
بدنبال رسوب گیری توسط سولفات آمونیوم آن را درون کیسه دیالیز که از قبل تیمار شده بود ریخته و در سردخانه قرار داده شد و به روی رسوب حاصل از محیط به غلظت ۱۰ میلی مولار تریس بافر ریختیم و رسوب را به طور کامل حل کردیم و در کیسه دیالیز ریخته و به مدت ۲۴ ساعت بر علیه تریس بافر سه بار تعویض انجام گرفت.سپس سوسپانسیون موجود در کیسه دیالیز از فیلتر سرنگی ۲۲/۰ میکرون جهت استریل کردن عبور داده شد. سپس اگزوتوکسین تولید شده از هر کدام از محیط ها را از ستون کروماتوگرافی رد می­کنیم و جذب نوری هر کدام از فراکشن ها را گرفته و به روش لوری پروتئین سنجی .
شکل ۳-۸- دیالیز
۳-۶-۱۰- کروماتوگرافی فیلتراسیون ژل اگزوتوکسین A
مراحل پک کردن ستون کروماتوگرافی:
۳-۱۶-۲-۱مواد مورد نیاز:
ژل سفاروزCL-4B (فارماسیا)
تامپون Nacl 2/0 مولار همراه با سدیم آزاید ۳ میلی مولار
تامپون Nacl 2/0 مولار
لوازم آزمایشگاهی مورد نیاز:
۱-ستون شیشه ­ای با طول ۱ متر و قطر ۵/۱ سانتی متر
۲-فرکشن کلتور اتوماتیک ، پمپ پاراستاتیک و لوله­های آزمایش جهت جمع آوری فراکشن­ها
به ۲۰۰ میلی لیتر سفارزCL-4B (فارماسیا) مقدار ۴۰۰ میلی لیتر کلرید سدیم ۲/۰مولار محتوی ۳ میلی مولار سدیم آزاید اضافه نموده و به آرامی تکان دادیم بعد از یک ساعت فاز مایع را همراه با ذرات بسیار کوچک سفارز خارج نموده و شستشو را آنقدر تکرار می‏کنیم تا سفارز یکنواخت به دست آید. به سفارز شسته شده ۲۰۰ میلی لیتر کلرید سدیم ۲/۰ مولار همراه با سدیم آزاید اضافه نموده و به کمک خلأ حباب‏های هوا را از سیستم خارج کردیم.
سفارز شسته شده را به آرامی داخل ستون ریخته و به کمک پمپ پاراستاتیک در فلوریت ۱۸ میلی لیتر در ساعت به طریقی پک کردیم که ارتفاع ژل به ۹۰ سانتی متر برسد. جهت استاندارد نمودن، ستون را ۳ مرتبه با حجمی برابر حجم ستون توسط کلرید سدیم ۲/۰ مولار شستشو دادیم .سپس مقدار ۲ سی سی از اگزوتوکسین بدست آمده از محیط تریپتیکاز سوی براث را از ستون رد کردیم و تمام فراکشن­های بدست آمده توسط کلکتور جمع­آوری شد.
۳-۶-۱۱سنجش تولید اگزوتوکسین A
۳-۶-۱۱-۱-سنجش توکسیسیتی
از هر ۳ فراکشن به دست آمده از ستون کروماتوگرافی در سرم فیزیولوژی رقت های ۰ تا یک بیستم تهیه می نماییم.۱/۰ میلی لیتر از هر رقت را به۳ گروه ۵ تایی موش های سفید آزمایشگاهی به صورت داخل صفاقی تزریق نمودیم . موش ها بعد از تزریق دارای علایمی همچون ترشحات چشمی، قوز کرده، مو‏های ژولیده، کوچکی چشم و در حال بسته شدن و عدم تعادل در حرکات نشان دادند و همه آنها در عرض ۴۸ ساعت از بین رفتند که نشانه ی بارزی جهت اثبات توکسیک بودن اگزوتوکسین ما می باشد. در کالبد شکافی مه بعد از مرگ انجام گرفت آثار توکسیک بر روی کلیه ها، سفیدی و تورم کبد و خونریزی زیه مشاهده شد . تا ۴۸
۳-۶-۱۲- دتوکسیفای کردن اگزوتوکسین A به روش فرمآلدیئد :
فراکشن ۲ که با انجام آزمایش توکسیسیتی به عنوان اگزوتوکسین اصلی شناخته شد، جهت دتوکسیفای کردن و کونژوگه مورد استفاده قرار گرفت. به این فراکشن به میزان ۵/۰% فرمالدهید ۳۷% اضافه گردید و به مدت یک شبانه روز در C°۴+ نگهداری گردید و به مدت ا روز دیالیز گردید. در مرحله بعدی همین اگزوتوکسین دتوکسی فای شده را از فیلتر سرنگی ۲۲/۰ میکرونی رد کردیم و لیوفلیزه شدند.